A microbiologia industrial, ambiental  e sanitária tem evoluído, e nesses últimos dez anos experimentou grande progresso em função das tecnologias emergentes. Toda ciência, até pela sua sobrevivência, deve ser dinâmica. Alguns correlatos científicos discutiam que em futuro próximo deveriam ser padronizadas e simplificadas as técnicas de detecção e identificação dos parâmetros microbiológicos para funções similares. Um novo método foi desenvolvido a partir da combinação de técnicas estabelecidas, incluindo filtração com uso de membrana, marcação de células com substrato fluorescente, microscopia de epifluorescência, com citometria a laser para contagem rápida de microrganismos e detecção de patógenos.  A técnica não é baseada em divisão celular para a contagem de microrganismos viáveis, a eliminação do processo de cultivo de microrganismos aumentou a velocidade da análise, o grau de certeza e a especificidade. A eficácia dos substratos utilizada para marcar as células viáveis tem sido comprovada em muitos estudos científicos. Padrões de microbiologia em tempo real com resultados de contagem de microrganismos em duas horas , detecção de coliformes e Escherichia coli em quatro horas tem sido sendo aplicados nas áreas: águas de abastecimento e ambiental, processamento industrial farmacêutico, de cosméticos, alimentos e bebidas. A detecção de microrganismos específicos também é possível incluindo os protozoários Cryptosporidium e Giárdia. A nova tecnologia vem permitindo encontrar soluções em tempo hábil, com respostas rápidas do nível de contaminação e ganhos substanciais na produção e melhoria do controle de qualidade microbiológico.  Muitas máquinas têm sido utilizadas, incluindo técnicas de contagem em microscopia direta (epifluorescência e imunofluorescência), radiometria, impedanciometria e metodologias bioquímicas. Estas técnicas podem fornecer uma rapidez de resultados, porém ainda requerem a fase de desenvolvimento celular. (cerca de 01 a 02 dias em pré-enriquecimento). Fig. 01 - Filtração Metodologia de filtração  acoplada a marcação de  substrato e citometria a laser  A amostra é filtrada em uma membrana de porosidade de 0.4 µm, onde os microrganismos são retidos na superfície do filtro.(Fig.1) Um contra corante é adicionado para minimizar a origem de fluorescência . A membrana é incubada com um tampão de pré-marcação para recuperação de células injuriadas ou estressadas. (fig.2) Microrganismos viáveis são marcados usando um substrato não fluorescente derivado da fluoresceína. O substrato é transportado por difusão atravessando a membrana celular, a enzima é acumulada na célula e atacada pela fluoresceína. (fig.3). A viabilidade dos substratos marcados é específica para células viáveis, tendo como princípio através a atividade enzimática e a integridade da membrana.Fig.02 - Marcação A atividade enzimática da esterase é utilizada para protocolos de contagem total de microrganismos("TVC & Fungi bioburden). Para E. coli e coliformes temos a atividade específica da ß-glucoronidase e ß-galactosidase, respectivamente.Fig.03  Em geral quatro regentes são necessários para marcar individualmente células viáveis de microrganismos. Um tampão pré-marcação auxilia na recuperação de células vegetativas injuriadas, estressadas ou esporuladas. Um contra-corante atua reduzindo a incidência de fluorescência antes do período de incubação, este reagente está presente no tampão pré-marcação. A solução de marcação é adicionada na amostra após a filtração., durante o transporte da membrana no "pad" saturado com o tampão de marcação. Após a marcação, a membrana é transferida para a fase sólida de citometria a laser. (Fig.4)Fig.04 A área total da superfície da membrana é escaneada pelo laser em 6 µm de diâmetro e comprimento de onda de 488 nm. Cada linha individual do laser é de 2,2 µm, assegurando que toda a divisão da membrana é iluminada duas vezes por sobreposição (Fig 5).Fig.05 O software exclui qualquer sinal que não é passado duas vezes. Dois leitores detectam a luz fluorescente emitida pelas células marcadas. A janela de leitura é coordenada de modo a permitir espectro fluorescente de 500-530 nm (verde) e 540-585 nm (âmbar). Os sinais produzidos pelos fotomultiplicadores são processados usando um software que discrimina a capacidade de diferenciar entre sinais confirmados (microrganismos marcados) e ruídos de interferência (eletrônica, ótica, partículas autofluores-centes).  A análise que discrimina o espectro fluorescente de cada sinal é proporcional à cor, a intensidade do sinal fluorescente e a intensidade de fluorescência. A fluorescência é determinada pela fase sólida do citômetro a laser do ChenScanR RDI As partículas autofluorescentes são detectadas e os dados são removidos. A leitura da membrana e os sinais são completados em menos de 3 (três) minutos. Somente células viáveis são capazes de se ligarem enzimaticamente a susbtratos não fluorescentes e acumularem fluorescência até o processo final do teste.  Os resultados lidos são revelados em contagem direta de células viáveis. Os dados podem ser lidos em um mapa da membrana, identificando a posição de cada célula marcada na superfície da mesma. (Fig. 6) O processo não destrói as células, o operador pode visualmente confirmar a presença de todas as células marcadas e confirmar a morfologia celular transferindo a membrana para um microscópio epifluorescente que pode ser acoplado ao sistema. Os resultados são rastreados por amostra, os dados da produção são catalogados e registrados em um formulário com informação da calibração do aparelho, um relatório completo com tendências estatísticas é elaborado.Fig.06 Detecção de Cryptosporydium e Giardia Amostras de água concentrada são pré-tratadas por separação imunomagnética (IMS), procedimento realizado para capturar oocistos e cistos e transportá-los para lâmina. A lâmina é incubada com solução de marcação que contém dois anticorpos monoclonais fluorescentes, específicos para Cryptosporidium e Giárdia. Os protozoários são determinados utilizando-se como critérios à figura do sinal, a intensidade da fluorescência e a proporção verde/vermelha de luz emitida. Assim como anticorpos monoclonais podem ligar não especificamente a outras partículas semelhantes a cistos ou oocistos, um estágio de confirmação microscópica é necessário. A citometria de fase sólida é capaz de realizar análise rápida automática em membrana de 25 mm de diâmetro em menos de três minutos. Uma aplicação especial tem sido desenvolvida para detecção de Cryptosporidium de água de superfície concentrada. Após a leitura a laser os resultados são disponíveis em um mapa escaneado, o qual identifica a posição dos oocistos na membrana de superfície.  Parâmetros de Análise  Realização da contagem de células viáveis de bactérias, esporos bacterianos e leveduras. Contagem de fungos filamentosos  O protocolo para contagem de microrganismos detecta bactérias, esporos bacterianos e leveduras. A análise pode ser realizada em 90 minutos para alguns produtos da indústria farmacêutica e até duas horas para análise de água com alta sensibilidade. Os esporos de fungos são detectados com um protocolo de análise de três horas, as leveduras são detectadas. * Contagem e detecção de coliformes totais  Coliformes totais presentes na amostra de água são retidos na membrana por filtração a vácuo. As células de coliformes totais retidas na membrana são tratadas com reagentes que induzem a produção da enzima ß-galactosidase e marcam células específicas.  * Contagem e detecção de Escherichia coli As células de Escherichia coli presentes na amostra de água são retidas na membrana por filtração a vácuo. As células de E. coli retidas na membrana são tratadas com reagentes que induzem a produção da enzima ß-glucuronidase e marcam as células específicas.  * Contagem e detecção de Cryptosporidium e Giardia  Os oocistos e cistos marcados com anticorpos são detectados pela citometria a laser e podem ser confirmados em microscopia. A detecção é realizada com kits individuais ou pesquisando-se Cryptosporidium e Giardia no mesmo protocolo. Aplicações O ChemScan é aceito pelo FDA ("Type V drug master file), validado pela USP 25 (USP Guidelines in Validation of Compedial Methods-1225 ( 3 ). A utilização para monitoramento em tempo real da qualidade microbiológica de água é ampla e outras aplicações têm sido validadas: Monitoramento de água para uso farmacêutico Para água de processamento farmacêutico o Chem Scan RDI é um método oficial publicado na Farmacopéia Americana USP 25 (3) e recomendado em vários estudos científicos por ser um método rápido, sensível e seguro (6, 8, 9, 10). Informações de vários estudos de águas farmacêuticas (incluindo água para injetáveis e purificada) asseguraram a contagem microbiana em menos de 02 horas e equivalente aos métodos tradicionais obtidos por plaqueamento (em meios R2A, com poucos nutrientes e incubados de 20 a 25°C por 14 dias). A especificidade foi grande pois para algumas amostras de água a detecção clássica pelos métodos de cultivos é limitada. A validação do processo para a rotina de análise de água pela empresa Bausch & Lomb (5), Novartis (8) demonstraram que a tecnologia proporcionou resultados equivalentes e até mesmo melhores em relação ao plaqueamento convencional em relação a detecção de microrganismos fastidiosos ou esporulados.  Empresas como GlaxoSmithKline, Pfizer, Schering, Astra Zenica e outras também utilizam o Chemscan RDI para rotina de análise de água. Indústria de filtráveis (produtos de higiene pessoal, medicamentos) Várias aplicações foram validadas em produtos filtráveis, destacando-se estudos de análise de solução anti-séptica tópica pela Sanofi-Synthelabo Rielss (5) onde microrganismos não cultiváveis foram detectados pelo novo método. A enumeração de produtos com atividade bacteriostática também pode ser realizada conforme a publicação da análise de espirami-cina pela Aventis Pharma (1). A análise de solução nasal pesquisada pela Novartis (8) demonstrou que o Chem Scan RDI permitiu detectar microrganismos em 57 amostras, enquanto a metodologia tradicional de membrana filtrante detectou apenas 16 amostras contaminadas. Os dados foram confirmados em microscopia. Água potável e ambiental Comparando-se metodologias para análise de água potável o método Chem RDI assegura benefícios inéditos capaz de detectar bactérias que perderam a capacidade de serem cultivadas "in vitro", a detecção é muito sensível pois a leitura da membrana filtrante é realizada por laser, os resultados são finalizados em menos de um dia. O estudo de análise de coliformes e E. coli foi desenvolvido em cooperação com o professor Hans Nelis (7) na Bélgica. A tecnologia tem sido empregada em países do Reino Unido, França (Vivendi), Bélgica, Korea devido a segurança e rapidez do método, em situações de emergência a detecção e contagem é realizada em horas. Para Crypstoporidium a tecnologia é compatível com todos os tipos de técnicas de concentração e purificação testadas para em amostras de água. Comparando-se a observações de microscópica direta, resultado foi equivalente ou superior, em relação ao número de oocistos.  O tempo total de análise em geral foi reduzido em até seis vezes (2,6). A observação do protozoário é mais rápida, sensível e segura e tem sido utilizadas por empresas de saneamento e centros de pesquisa. Conclusões A sensibilidade do método é permitir resultados coerentes ou superiores à metodologia tradicional para detec-ção e contagem de microrganismos em vários tipos de amostras filtráveis em tempo real.  Detectar microrganismos de difícil cultivo ou submetidos a tratamentos com solução antimicrobiana foi possível com o novo método. No entanto, a metodologia baseada em cultivo, tradicional ou automatizada dificulta a análise de microrganismos.  O controle do processo industrial ou monitoramento ambiental pode ser realizado em horas, podendo-se aplicar um controle de qualidade "just in time" com a liberação segura de produtos acabados, controle da matéria-prima ,monitoramento da água de proces-samento , ambiente e manipuladores. As empresas que adotaram a meto-dologia em sua rotina de trabalho contabilizaram benefícios aos programas de análise de pontos críticos de controle, diminuíram o estoque de produtos em quarentena, aumentaram o controle de qualidade e a sensibilidade dos testes, incluindo a detecção de biofilmes, esporulados e microrganismos fastidiosos.